在渗透的作用下，原油中的烷烃类分子穿过细胞膜;再在降解酶的作用下，烷烃类分子被转化为槐糖脂类生物表面活性剂。生物表面活性剂的产生有利于废水中污油组分的乳化增溶，进而提高S.bombicola对石油烃的摄取效率。

图3(a)、(b)为S.bombicola在油浓度为0.5%废水中生长第1天和第10天时的TEM照片，图3(c)为未添加O-13-1菌株的降解体系中土著菌群细胞的TEM照片。在降解第1天时，部分O-13-1菌株内部有透明液泡，并在降解第10天时逐渐变大，推测为所含原油中烷烃类物质凝聚而成。这与Singer等的研究结果基本一致，他们发现不动杆菌(Acinetobactersp.)HO1-N在降解正构烷烃后，HO1-N菌体细胞内部出现由烷烃构成的透明囊泡。而未添加O-13-1菌株的降解体系中，石油烃类物质难以通过被动运输直接进入细胞内，故细胞内鲜有液泡产生。O-13-1菌体细胞内烷烃液滴的出现说明在槐糖脂类表面活性剂的作用下，烷烃从胞外到胞内的运输过程大大增快，从而有利于胞内烃氧化酶的吸收利用。

图3培养体系中添加球拟假丝酵母菌培养1d(a)、10d(b)和未添加球拟假丝酵母(c)细胞结构的变化

2.2菌株O-13-1强化降解石油烃产生物表面活性剂的结构鉴定

2.2.1菌株O-13-1强化降解含油废水的表面张力

不同培养体系经10d降解后表面张力变化如表2所示。油浓度为0.8%、0.5%和0.3%的培养液表面张力分别为36.9、38.0和47.8 mN/m，相较于对照组分别降低了22.1、18.3和9.3 mN/m。其中，油浓度为0.8%和0.5%的培养体系的表面张力均小于槐糖脂溶液的临界胶束浓度(CMC)所对应的最低表面张力(37.0 mN/m)。该结果说明了O-13-1菌株以采油废水作为发酵底物产生的槐糖脂具有较高的应用效率。

目前，油田采出废水主要用于回注油藏继续进行注水采收。由于石油开采过程对回注水水质要求较高，污水对油藏适应性差且水驱采收率低下等原因，油田采出水循环利用效率较低。将采油废水作为槐糖脂的发酵碳源，大量含有易生物降解、高表面活性的生物表面活性剂的回注水为三次采油提供了新的思路。

表2不同培养体系经10d降解后的废水中的表面张力和槐糖脂产量

注:-:未检测出。Nodetected.

2.2.2菌株O-13-1产表面活性剂结构初步鉴定

三组实验发酵结束后均能利用乙酸乙酯提取出棕黄色物质，TLC可定性分析菌株O-13-1发酵得到的粗提产物。粗提产物与槐糖脂纯品的TLC结果对比如图4所示。由图可知，粗提产物(1)显棕黄色且与槐糖脂纯品(2)显色较深的点位置相同，说明粗提产物中有糖脂存在。同时，计算该点对应化合物的比移值(Rf)均为0.65左右，与文献报道的槐糖脂内酯分子的Rf值相一致。据此，可初步判定粗提产物中存在槐糖脂。

图4假丝酵母菌产表面活性剂薄层层析(TLC)其中(1)为粗提产物;(2)为槐糖脂纯品标准物质。

2.2.3菌株O-13-1产表面活性剂HPLC-MS结构鉴定

图5和图6分别给出了假丝酵母菌O-13-1降解原油纯化产物的HPLC-MS总离子流图和保留时间为3.1min的组分质谱图。可以看出，该纯化物质含有11种酸型或内酯型槐糖脂同系物，其中保留时间为2.1、2.5 min为酸型槐糖脂，其余均为内酯型槐糖脂。这与HuYongmei等的研究成果基本相同，他们发现在以十六烷为碳源发酵生产槐糖脂时，内脂型槐糖脂在产物中占多数。在此培养体系槐糖脂的生物合成途径中，主要步骤为细胞色素P450单加氧酶介导的烷烃氧化成脂肪醇，随后通过衍生醇和醛的氧化进一步转化为脂肪酸，因此，槐糖脂的结构与生产所用碳源有密切关系。

保留时间为3.1 min时色谱峰丰度最高。对该物质进行详细分析，质荷比(m/z)645.32的碎片为单乙酰基取代的内酯型槐糖脂的分子离子峰，m/z 667.32为[M+Na]+峰，m/z 483.29为[M+H-C8H12O6]+峰，其中C8H12O6为乙酰基取代糖环。上述分析表明此物质为内酯型槐糖脂，具体名称为:17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)-O-]十八二烯酸-1'，4″-内酯-6″乙酸酯。

另外，保留时间为6.5、6.9min的峰具有相同的主要离子碎片，二者可能互为同分异构体。已有文献证明，在槐糖内脂的形成过程中，大多数脂肪酸通过ω-1位置连接，因此ω型槐糖脂含量较低。保留时间为6.5 min时色谱峰丰度比6.9 min较小，故保留时间为6.5 min对应组分为ω型槐糖脂，保留时间为6.9 min对应组分为ω-1型槐糖脂。利用质谱将槐糖脂纯化物电离成具有不同质量的离子，得到不同保留时间的峰的离子信息，进而得到槐糖脂同系物的具体信息，见表3。综上，可确定球拟假丝酵母菌O-13-1在降解采油废水中石油烃组分的同时，分泌了生物表面活性剂槐糖脂。

图5 O-13-1菌株产槐糖脂HPLC-MS总离子流图

图6保留时间3.1 min组分的质谱

表3球拟假丝酵母菌O-13-1所产槐糖脂同系物结构鉴定

3结论

(1)O-13-1菌株在原油浓度0.8%、0.5%和0.3%水平下中等碳数(C17—C28)组分生物降解率分别为7.0%~12.8%、17.9%~44.0%和4.5%~27.7%，结果表明O-13-1菌株在发酵过程中可利用采油废水中原油的正构烷烃组分作为碳源生长。

(2)对发酵产物的鉴定及结构分析表明，O-13-1菌株利用采油废水发酵所产表面活性剂中含有11种由乙酰基取代的内酯型和酸型槐糖脂同系物，其中2种为酸型槐糖脂，其余为内脂型。所产槐糖脂中含量最高的是17-L-[(2'-O-β-D-吡喃葡萄糖基-β-D-吡喃葡萄糖基)-O-]十八二烯酸-1'，4″-内酯-6″乙酸酯。在以采油废水为碳源的发酵实验中，原油浓度为0.8%、0.5%和0.3%的三组发酵液表面张力相较于空白组分别降低了37.5%、32.5%和16.3%。结果表明O-13-1菌株以采油废水作为发酵底物产生的槐糖脂具有较高的应用效率，为采油废水的回注处理及三次采油提供了新思路。